آنالیز قطعات حاصل از برش با آنزیم Cleavase I ؛CFLP

روش CFLPیکی از روشهای شناسایی جهشهامیباشد.اساس این روش همانند روش SSCP بر پایه تفاوت در ساختارفضایی سه بعدی توالیهای DNA تک رشته ای مختلف است.در روش فوق ، ابتدا dsDNA بوسیله حرارت واسرشت شده  سپس سریعا سرد میشود تا ssDNA  تشکیل شود . درساحتار فضایی سه بعدی ، بر حسب توالی  ssDNA  در نقاطی پیوندهای هیدروژنی تشکیل شده و شاختارهای دو رشته ای شبه سنجاق سری ،ایجاد میکنند. در مرحله بعد ، به محلول حاوی  توالیهای DNA ، آنزیم Cleavase I اضافه میشود.این آنزیم DNA را در نقاطی که ساختار تک رشته ای به دو رشته ای تبدیل شده ، برش میدهد .در صورتی که در توالی DNA جهش روی داده باشد،آرایش فضایی پیوندهای هیدروژنی تغییر خواهد کرد و در نتیجه در اثر آنزیم  Cleavase I قطعاتی متفاوت با قطعات حاصل ار توالی طبیعی ، ایجاد خواهد شد. به این پلی مورفیسم ،CFLP(Cleavase Fragment Length Polymorphism)گفته میشود .بعنوان مثالی از کاربرد این روش ،میتوان به شناسایی جهش R538C (تبدیل کد اسید آمینه آرژنین  به سیستئین)در ژن کد کننده آنزیم بیوتینیداز(ژنBTD واقع در ناحیه3p25)، اشاره کرد.این جهش یکی از جهشهای شایع در افراد مبتلا به نقص آنزیم بیوتینیداز است.برای شناسایی این جهش به روش CFLP ،ابتدا توالیهای اطراف نقطه ای که انتظار جهش در آن وجود دارد (توالی حاوی کدون450 تا 650)،بکمک PCR تکثیر شده و سپس dsDNAهای تکثیر شده به ssDNA تبدیل میشوند.پس از اضافه کردن آنزیم  Cleavase I ،قطعات ایجاد شده الکتروفورز میشوند.توالی هایی که دارای جهش R538C باشند، در آنزیم Cleavase Iبه 7 قطعه تبدیل میشوند که هریک دارای وزن مولکولی خاصی است. اما توالیهایی که فاقد جهش فوق باشند به 11 قطعه باوزن مولکولی متفاوت تبدیل میشوند. به این ترتیب، از روی این نوع پلی مورفیسم یا  CFLPمیتوان به وجود جهش فوق پی برد.  منبع:
Maddox LO, Li P, Bennett A, Descartes M, Thompson JN (1997)Comparison of SSCP analysis and CFLP analysis for mutation detection in the human iduronate 2-sulfatase gene. Biochem Mol Biol Int. 43(6):1163-71 

 

/ 1 نظر / 42 بازدید
سامان

سایت خیلی جالب و مفیدی دارین [قلب][گل] (خیلی ممنونم به به) امیدوارم به کارتون ادامه بدین[دست]