استخراجDNA از خون

پروتکل استانداردی که در آزمایشگاههای مولکولی برای استخراج DNA بکار میرود به شرح زیر است:

(ترکیبات محلولها در آخر متن آمده است)


الف)استخراجDNA از خون با محلول نمکی
1)به میزان 5/0 میلی لیتر از محلول EDTA نیم مولار(یا 10%) را به 5 میلی لیتر خون اضافه کرده خوب تکان دهید تا مخلوط شود.
2) 100میکرو لیتر از محلول فوق را به اپندورف 5/1 منتقل کنید.
3)1 میلی لیتر از بافر A به اپندورف اضافه کرده ورتکس کنید سپس برای 10 دقیقه در محیط آزمایشگاه نگهدارید.
4)به مدت 10 دقیقه در دور 6000 سانتریفوژ کنید.سوپرناتانت را دور بریزید.
5)مراحل 3و4 را یکبار تکرار کنید.
6)به رسوب سفید ، 5/0 میلی لیتر بافرB را اضافه کرده و ورتکس کنید.
7)به محلول فوق50 میکرولیتر SDS 10% اضافه کرده و ورتکس کنید.محلول را برای 15 دقیقه در دمای محیط نگهداری کنید.
8)تیوبها را 5 دقیقه در دور 12000 سانتریفوژ کنید.
9)به محتوی تیوبها 300 میکرولیتر از محلول کلرید سدیم 6 مولار اضافه نموده و ورتکس کنید تا هموگلوبین بصورت رسوب قهوه ای رنگ ظاهر شود.
10)لوله ها را به مدت 15 دقیقه در 14000 دور،سانتریفوژ کنید.سوپر ناتانت حاوی DNA است.
11)5/0 میلی لیتر ازسوپرناتانت را به لوله جدیدی منتقل کرده و با دو حجم(1 میلی لیتر) اتانول 95% سرد،DNA را رسوب دهید.
12)لوله ها را بمدت 10 دقیقه در 12000 دور سانتریفوژ کنید.
13)سوپرناتانت را دور ریخته و رسوب را با الکل 70% (با دمای محیط)شسته و خشک نمائید.
14) رسوب DNA را در 50 میکرولیتر محلول TE(1x) حل کنید.



ب)استخراج DNA از خون با روش جوشاندن
به میزان 5/0 میلی لیتر از محلول EDTA 5/. مولار را به 5 سی سی خون اضافه کرده خوب تکان دهید تا مخلوط شود.
2) 5/0 میلی لیتر از محلول فوق را به اپندورف 5/1 منتقل کنید.
3)1 میلی لیتر از بافر A به اپندورف اضافه کرده ورتکس کنید.
4)به مدت 2 دقیقه در دور 12000 سانتریفوژ کنید.سوپرناتانت را دور بریزید.
5)مراحل 3و4 را یکبار تکرار کنید.
6)به رسوب سفید،100میکرولیتر محلول C را اضافه کرده و ورتکس کنید.
7)اپندورفها را در حالت در بسته،بصورت شناور(با استفاده از یونولیت)در آب جوش قرار دهید.
8)تیوبها را از آب جوش خارج کرده و 20 میکرولیتر از بافرD به آن اضافه کنید.
9)به مدت 30 ثانیه در میکرو سانتریفوژ،سانتریفوژ کنید. سوپرناتانت حاوی DNA است.
10)5/0 میلی لیتر ازسوپرناتانت را به لوله جدیدی منتقل کرده و با دو حجم(1 میلی لیتر) اتانول 95% سرد،DNA را رسوب دهید.
11)لوله ها را بمدت 10 دقیقه در 12000 دور سانتریفوژ کنید.
12)سوپرناتانت را دور ریخته و رسوب را با الکل 70% شسته و خشک نمائید.
13) رسوب DNA را در 50 میکرولیتر محلول TE(1x) حل کنید.


محلولها:
بافرA: شامل تریس هیدروکلریک 12 میلی مولار،گلوکز(یا ساکارز):32/0 مولار، MgCl2 پنج میلی مولار،تریتونX-100 یک درصد

بافرB:کلرید سدیم سی و هفت صدم مولار،EDTA دوازده صدم مولار

بافرC:محلول NaOH پنجاه میلی مولار

بافر D: تریس هیدروکلریک یک مولار

بافرLysis:تریس هیدروکلریک یکدهم مولار،EDTA پنجاه میلی مولار، SDS یک درصد

بافر1xTE :تریس هیدروکلریک ده میلی مولار و EDTA یک میلی مولار

/ 4 نظر / 382 بازدید
مرکز تحقیقات دانشگاه

خوب بود

محسن

خسته نباشید آقای خزایی خیلی ممنون

میکروتک

فروش ویژه و استثنایی تانک الکتروفورز http://irmicrotech.ir/

padide

kheilio khoobo kamel vali osoolan ma daneshjoha ravesh karo darim feghat dalile estefade az har marhale ya har made ro niaz darim