آرشیو وبلاگ
      یاخته‌نامک (دانش و پژوهش)
آپتامر و کاربردهای آن در ساخت بیوسنسورها ۱۳۸٢/٤/۱
مقدمه
اسیدهای نوکلوئیک مصنوعی می توانند بر علیه پروتئینها- اسیدهای نوکلوئیک سایر ماکرومولکولها- داروها و حتی نوکلوتیدها ساخته شوند. آپتامرها را از کتابخانه های پیچیده اسیدنوکلوئیک سنتزی به کمک یکسری فرایند تکراری جذب و بازیافت و تکثیر دوباره جداسازی می کنند. آپتامرها کاربردهای بالقوه ای در وسائل آنالیز گر شامل بیوسنسورها و عوامل درمانی “therqputic agents” دارند. اندازه آنها بین 6 تا 40 کیلودالتون است و گاهی دارای ساختارهای سه بعدی ویژه و پیچیده هستند. KO یا Dissociation constant آنها از اهداف خود خیلی پایین و در حد ناذومولار است. آپتامرها می توانند انانیتومرهای ملکولهای کوچک و حتی تفاوت توالی های ناچیز را به راحتی تشخیص دهند. آپتامرها بیشتر RNA یا DNA و یا ترکیبی از ایندو با ملکولهای غیر طبیعی هستند. در فرایند تکراری بدست آوردن آپتامر می توان در هر سیکل تغییرات لازم را انجام داد و آنچه در این بین جالب است رخدادن تکامل داروینی به صورت موثر و در شیشه است.(Dar winian Evelution).پس از Darwinian Evelution ، پس از غنی سازی های مناسب آپتامرها می توانند کلون شوند و به عنوان جمعیتی از توالی های هوموژن مورد بررسی قرار گیرند

فرایند تولید یک لیگاند از اسیدهای نوکلئیک
الف) سنتز کتابخانه ها و پیچیدگیهای آن:
شیمی ترکیبی combinatovial chemistry عبارت است از تولید جمعیت زیادی از ملکولهای متفاوت با استفاده تکراری از فرایندهای محدود سنتزی ساده و مشخص.
در این مورد فرایند سنتز فاز جامد اولیگونوکلئوتیدی صورت می گیرد. در فرایند ساخت تک رشته گروه عاملی خاص به وسیله یک محافظ protectator غیر فعال شده است با حذف protectonr فعال می شود. با ایجاد تغییراتی ساده (استفاده از ماسک های مناسب) می توان مرحله فعال سازی را برای گروه های عاملی فراوان انجام داد و به این طریق می توان جمعیتی از اولیگونوکلئوتیدهای تصادفی بدست آورد. به این ترتیب که یک کتابخانه اسید نوکلئیک با طول چهل نوکلئوتید دارای تنوع حداکثر 440 میباشد (1024 × 2/1) این تعداد ترکیب مختلف را sequence space می گویند که می تواند با ایجاد تغییرات افزایش دیگر حتی چندین برابر شود. (این تعداد هیچگاه سنتز نمی شود)

ب) انتخاب خصوصیت مورد نظر
توانائی مورد نظر، توانائی اتصال به ملکولی است که ما در نظر گرفته ایم و بسته به نوع کاربردی که مد نظر است این خصوصیت می تواند جذب سریع – جداشدن کند - گرایش بالا و یا گرایش پایین به ملکولهای خیلی مشابه و یا ترکیبی از موارد بالا باشد اینگونه توانائی ها (Properties) می توانند در اثر ساختمان سه بعدی اسید نوکلئیک مورد نظر ایجاد شوند و بطور مشخص ساختمان سه بعدی یک توالی اسید نوکلئیک را ترتیب بازهای آن را مشخص می کنند. به وسیله مخلوط کردن کتابخانه فاز محلول solution phase library با ملکول هدف و جداسازی مجدد ملکول هدف (حذف اولیگوهائی که یا متصل شده اند و یا ضعیف متصل شده اند) می توان اولیگونوکلئوتیدهای دارای خصوصیت مورد نظر را جداسازی نمود. (این مرحله بیشتر شبیه به (affinity chromatography) است.

ج) کدگذاری ژنتیکی Genetic encoding
چون آپتامر مورد نظر توالی از ملکولهای اسید نوکلئیک است می تواند به وسیله روشهای معمول ملکولی مثل RT-PCR, PCR تکثیر یابند Reverse transcription (R-T) Polymerase chain recution (PCR)

د) غنی سازی و تکامل Enrichment and evelution
چون جداسازی گرایشی خالی از اشکال نیست سیکل جداسازی و تکثیر بین 6 تا 12 مرتبه تکرار می شود در این حالت تنوع توالی از حالت ابتدائی space- sequence کمتر است(مثلاً از 24 10 حالت به جمعیتی از 10 توالی مجزا که خصوصیات مورد نظر را نشان می دهند کاهش می یابد) به علت اینکه آنزیمهائی که فرایند همانندسازی اسید نوکلئیک مورد نظر انجام می دهند خاصیت اصلاح اشتباهات را ندارند (proof-reading) پس به راحتی دچار اشتباه می شوند و این یک مزیت است زیرا به وسیله آن می توان نمودی از تکامل داروینی به وسیله انتخاب طبیعی را در برخی موارد مشاهده کرد.
چون یکی از مشکلاتی که در مورد RNA در pH های بالا وجود دارد فعال بودن 2΄oH است که باعث حمله به نوکلوئید مجاور و ایجاد یک نوکلئوتید حلقوی و ناپایداری رشته می شود در بیشتر موارد تصمیم گرفته می شود که یا 2΄oH را غیر فعال کننده و یا اینکه ساختار پیوند فسفودراتر در ستون فقرات رشته back bone را تغییر دهند.
برای غیر فعال سازی 2΄oH آن را به وسیله یک گروه آمین ویا فلئور جایگزین می کنیم(یکی بار مثبت و دیگری بار منفی دارد و این به نوع ماربرد آپتامر بستگی دارد)بازه قابل توجهی از فعالیتهای آنزیمی برای اسیدهای نوکلوئیک قابل تصوراست و پیوندهای هیدروژنی و سایر خصوصیات آن از جمله واکنشهای اتصالی بین بازهای آنها تولید جعبه ابزاری متنوعی (tool box) از موتیف های ساختاری را در آنها ایجاد می کند .

هـ) مولکولهای هدف آپتامر
آپتامرها می توان بر علیه یونها مثلاً Zn 2+، تولید نوکلئوتیدها، ATP ، اولیگوپپتیدها گلیکوپروتئینهای بزرگ مثل CD4 و … ایجاد کرد.
به محلهای اتصال آپتامر«آپتاتوپ» می گویند. در استفاده های in vivo برای آپتامرها می توان از آنها به عنوان Magic bullet استفاده کرد که ملکول مورد نظر را تعقیب کرده و از بین ببرند.
مهمترین مسأله در مورد آپتامرها و استفاده in vivo از آنها مسأله Pharmacokinetic اولیگونوکلئوتیدها است. (سرعتی که به وسیله نوکلئازهای پلاسمائی از بین می روند) سرعتی که آنها به وسیله سیستم رتیکولوآندوقلیال از مسیر خارج می شوند و سرعت جذب آنها در کلیه ها و سرعت جذب در بافتها و …
مطالعه نیمه عمر آپتامرهای DNA تک رشته ای در خون چیزی شبیه به 2 تا 8 دقیقه را نشان می دهد. البته کانژوگاسیون آپتامرها با لیپیدها و یا پلی اتیلن گلایکول نشان داده است که توانائی بقای آنها به حدی بالا رفته است که می توانند به عنوان یک عامل درمانی عمل کنند. همچنین از آپتامرها می توان در ژن تراپی برای جلوگیری از بیان ژنها و … استفاده کرد
حال به چگونگی استفاده از آپتامرها برای ساخت بیوسنسورها می پردازیم
توانائی های این بیوسنسورها عبارتند از:
اندازه گیری همزمان صدها گونه ملکولی متفاوت ،حساسیت بسیار بالا،اختصاصیت بسیار بالا ، آنالیز سریع، اصول شیمیایی بسیار ساده که به راحتی می تواند اتوماتیک شود.

مسأله مهمتر در مورد بیوسنسورها استفاده از یک تکنیک فلئورسنت بسیار حساس به صورتی است که می تواند یک ملکول را شناسائی کند. در مورد تکنیک فلئورسنت روشهای محو تدریجی ناحیه تحریک شده بسیار قدرتمند هستند. در این تکنیک ها آپتامر را روی یک اسلاید شیشه ای قرار می دهند.

در این حالت اگر چه نور ایجاد شده تماماً بازتابش می شود مقداری انرژی به بیرون شیشه در محیط گسترش پیدا می کند که بصورت تعریفی یک ناحیه الکترومگنیک تخریبی را نزدیک سطح شیشه ایجاد می کند این ناحیه را evanescance field می گویند. که خود می تواند بصورت اختصاصی برای تحریک ملکولهای نزدیک سطح شیشه عمل کند با استفاده از این روشها می توان یک ملکول آپتامر متصل به یک ملکول هدف را شناسائی کرد.
پس از انقلابی که DNA چیپها ایجاد کردند(مطالعه ژنوم- تعیین توالی سریع DNA ژنومی- بررسی انواع جهشها و تشخیص جهشها در ژنهای خاص- آنالیز بیان ژنوم موجودات در شرایط مختلف- بررسی ژنهای اختصاصی بافتها و…)

حال نوبت به بررسی آنالیزی Proteom و یا تمامی پروتئینهای یک سلول خاص با ژنوم مشخص فرا رسیده است. برای اندازه گیری دقیق و روتین 102 تا 105 پروتئین مختلف به نظر می رسد که ساختن یک aptamer chip مفید واقع شود(Nucleic acid aptamer microarray chip) . تفاوت اساسی بین چیپهای DNA و چیپهای آپتامر در نوع واکنشهائی است که بین پروب در چیپ با ملکول هدف در محلول صورت می گیرد. در DNA چیپها اتصالات از نوع base paiving بین پروب و ملکول مورد نظر صورت می گیرد در حالی که در مورد آپتامر چیپ ها ملکول دارای ساختار سوم مشخص، به وسیله یک لینکرlinker به سطح چیپ متصل می شود. به عبارت دیگر می توان گفت که آپتامر ها به عنوان یک آنتی بادی عمل می کنند با این تفاوت که حتی از خالص ترین آنتی بادی های مونوکلونال با گرایش بیشتر و اختصاصیت بالاتری عمل می کنند.
برای شناسائی آپتامر متصل شده به ملکول هدف چهار روش ارائه شده که به توضیح کوتاه در مورد آنها می پردازیم.


1-روش Sand witch techique
این روش استفاده از آپتامر در تکنیکی مشابه Elisa است. در تکنیکی آن را ELANAنامیده اند و در کمپانی نکستار Nextar ایجاد شده یک آنتی بادی مونوکلونال را Immobilized می کنند و آنگاه به وسیله یک آپتامر نشاندار علامتگذاری می شود. اگر چه تا به امروز هنوز از آپتامر هم برای immobilization و هم برای Lableing استفاده نشده است ولی پیشرفتهای جدید افقهای تازه را می گشاید.

2- روش de-quenching Fluorescent signals in Aptamer Beacons
Molecular beacon ها شامل یک توالی نوکلئوتیدی هستند که در دو طرف خود دارای توالی های مکمل می باشند این دو توالی انتهائی با یکدیگر base pair می دهند و باعث می شوند که اولیگونوکلئوتید به صورت hair pin در آید. در دو انتهای این اولیگونوکلئوتیدها هم ماده فلئورسنت و هم ماده quencher (اطفاء گر) وجود دارد در صورت عدم اتصال این نشانگر، به هدف در اثرا ایجاد ساختار Stem-loop ، ماده فلئورسنت در مقابل quencher قرار می گیرد و در نتیجه نوری ساطع نمی شود و به این ترتیب می توان Beacon هائی ایجاد کرد که بر علیه ساختار های دوم و یا سوم مشخص از آپتامر ها اختصاصی هستند.

3- روش ModuLation of Fluorescense Anisotropy
در این روش بررسی تغییرات نابرابر در میزان فلئورسانس آپتامر نشاندار صورت می گیرد. یکی از مشکلات این روش این است که بین دو سیلگنال نوری قوی و ضعیف باید سیگنال نوری ضعیفتر را شناسائی کرد. اگر چه اتصال آپتامر به ملکولهای کوچک صورت می گیرد ولی به علت اینکه میزان نوری که از یک ناحیه کوچک ساطع نمی شود کمتر قابل تشخیص است در این روش برای حداقل اندازه هدف آپتامر محدودیت وجود دارد.

4- روش Modulation of Fluorecunt emission by signaling Aptamer
وقتی که آپتامرها به لیگاندهای خود متصل می شوند دچار تغییر شکل فضائی می شوند و در تحقیقاتی که در آزمایشگاه های دانشگاه Ellington صورت گرفته است مشخص شده که میزان شدت فلئورسنت تابش یافته پس از اتصال آپتامر به لیگاند دچار تغییرات قابل تشخیص می شود و به این طریق می توان اتصال آپتامرها به اهدافشان را نشان داد.
و همواره علم به جلو می رود و روشها و تکنیک های تعجب آوری ایجاد می گردد و حداقل کاری که می توان انجام داد این است که با اصول آن ها آشنا شویم شاید روزی فاصله تکنولوژی بین جوامع آنقدر کم شود که یک ایرانی هم در ایران بتواند تولید کننده تکنولوژی باشد و نه مصرف کننده آن.
لینک      نظرات ()      

مطالب اخیر استفاده از سلول های بنیادی برای درمان آسب های نخاعی نخستین همایش زیست شناسی دانشجویان و دانش پژوهان ایرانی در اروپا نانوتکنولوژی DNA آنزیمهای محدود کننده مصنوعی تشخیص زود هنگام سرطانها به کمک آپتامرها تعیین مقدار متابولیت های سلولی به کمک آپتامرها کاربرد آپتامر ها در تشخیص مولکولی بیماری های عفونی روش تهیه آپتامر ها آپتامر ها وکاربرد آنها درتشخیص مولکولی بیماری ها آنتی بادیهای غیر عادی در شترها
کلمات کلیدی وبلاگ سلولی (۱٦) تکنیک آزمایشگاهی (۱٤) ژنتیک (۱٠) مولکولی (۸) نانوبیوتکنولوژی (۸) نورولوژی (٧) بیوشیمی (٦) پروتئومیک (٥) ایمونولوژی (٤) میکروبیولوژی (٤) بیوتکنولوژی (۳) سرطان (٢)
دوستان من